Neofect™ DNA transfection reagent 为本公司研发合成的以非脂质阳离子聚合物为主的转染试剂，是新一代非病毒转染试剂。可以与DNA形成稳定的复合物，透过细胞膜进入细胞内，并保护DNA免受核酸酶的降解。该试剂对细胞毒性很小，可在含血清与抗生素的完全培养基中充分发挥作用。由于其温和高效的转染效率，非常适合病毒包装实验。
一：转染293T细胞
（以6 cm培养皿为例，不同培养体积使用情况见Table.1）
1. 转染前24 h，用胰蛋白酶消化对数生长期的293T细胞，以含10%血清的培养基调整细胞密度为1*106
细胞，重新接种于6
cm细胞培养皿，37℃ 5% CO2 培养箱内培养。24 h待细胞密度达70%～90%时即可用于转染。
细胞状态对于病毒包装至关重要，因此需要保证良好的细胞状态和较少的传代次数。
2. 在转染前2小时，移除细胞上原有的培养基，换为新鲜的完全培养基（含10%血清的DMEM培养基）。
注意：培养基请勿添加抗生素
3. 向一灭菌离心管中加入所制备的各DNA总量4-10ug，并加入相应体积的Opti-MEM混合均匀，调整总体积为 4 ml，在室温下温育5 分钟（见Table.1）。
核心质粒 4µg
包装质粒 ：psPax2 3µg （四代系统 pMDLg/pRRE 2µg + pRSV-Rev 1µg）
病毒外壳质粒： pMD2.G 1~2 µg
注意：无血清稀释液建议采用Opti-MEM，无血清DMEM或150 mM NaCl溶液。
4. 向DNA稀释液中直接加入相应比例（DNA总量：Nefect = 1:1）4-10ul Neofect™ DNA transfection reagent轻柔混匀，
室温静置15-30分钟。转染复合物制备完成。
5． 将转染复合物加入细胞培养基中，轻柔混匀。
二：转染后换液（推荐）
6. 细胞转染6-12小时以后，检查细胞状态。将培养基吸走，添加新鲜的DMEM完全培养基。
7. 将培养皿返还到培养箱中。确保培养皿水平放置。
Table.1 不同细胞培养容器转染用量
| 细胞培养容器 | 起始铺板细胞数 | Opt-MEM 体积 | DNA的总量 | Neofect™的量 | 培养基总量 |
|---|---|---|---|---|---|
| 60 mm dish | 1*106 | 200 µl | 4-10 µg | 4-10 µl | 4 ml |
| 100 mm dish | 2.0~3.0*106 | 500 µl | 10-20 µg | 10-20 µl | 10 ml |
| 150 mm dish | 7.0~8.0*106 | 1 ML | 30-50 ug | 30-50 ul | 30 ml |
三：观察转染效率
转染24-48小时候观察转染效果。融合的多核细胞开始出现，大多数细胞仍然是贴壁的。如果载体质粒上带有荧光标
记，并且其启动子能够在293T 细胞中表达，那么可以看到超过95%细胞都会带有荧光。
四：病毒上清的收集
分别收集转染后24h,48h（以转染后时间为开始时间）的病毒上清，用0.45 um的滤器过滤病毒上清或3000rpm离心5分
钟，收集后置于4度冰箱保存，可直接用于感染实验。（4度只能保存14天）。
五：病毒浓缩（可选）
1. 将上步处理好的细胞上清样品分装33ml 到每个离心管中。
2. 将离心管两两配平，使重量偏差在0.1g 范围内。配平后盖上金属盖。
3. 使配平的离心管对称放置于超速离心转子中。
4. 设置离心转速100000g，4℃ 离心2 小时。
5. 离心结束后，将离心管从转子中拿出，可以看到在离心管底有一小团沉淀，倒掉上清。
将离心管倒扣在预先铺好的纸巾上，放置10 分钟，使残余液体流掉。可以用移液枪将挂在壁上的液滴吸走。
6. 加入无血清培养基（Opti-MEM 或 PBS/1% BSA）重悬病毒颗粒，保存于-80度
注意：如需感染非常敏感的细胞，建议加入4ML 20% 蔗糖到离心管底部并加入 26 ml 病毒上清液进行离心操作。
